Czy MST to przełom w badaniach enzymatycznych?
Mikroskopowa termofoza (MST) zyskała w ostatniej dekadzie uznanie jako innowacyjna metoda badania interakcji białko-ligand, oferując szereg korzyści w porównaniu do technik tradycyjnych. Nowe badanie systematycznie analizuje wpływ powszechnie stosowanych dodatków buforowych na wiarygodność oznaczeń MST i aktywność enzymatyczną, wykorzystując hyaluronidazę jako modelowy enzym o istotnym znaczeniu klinicznym.
Hyaluronidaza to enzym rozkładający kwas hialuronowy (HA) – kluczowy składnik macierzy pozakomórkowej odpowiedzialny za właściwości lepkosprężyste i nawilżające tkanek. W medycynie hyaluronidaza znajduje zastosowanie w okulistyce jako adiuwant ułatwiający działanie leków iniekcyjnych oraz w dermatologii do leczenia powikłań po wstrzyknięciu wypełniaczy. Degradacja HA prowadzi do powstania fragmentów stymulujących angiogenezę, produkcję cytokin prozapalnych i aktywację szlaków sygnałowych istotnych dla progresji nowotworów, co czyni inhibitory hyaluronidazy potencjalnie wartościowymi narzędziami terapeutycznymi.
Jak działa mikroskopowa termofoza i jakie daje możliwości?
Technologia MST opiera się na ruchu cząsteczek w mikroskopowym gradiencie temperatury generowanym przez laser podczerwony (1480 nm). Lokalne ogrzewanie próbek załadowanych do cienkich kapilar o 2-6°C wywołuje termoosmotyczny ruch fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek. Ten ruch, w stałych warunkach buforowych, zależy od stanu znakowanej cząsteczki – czy jest związana z ligandem czy nie. Główną zaletą MST jest możliwość prowadzenia badań powinowactwa między dwoma partnerami o różnych rozmiarach, z dowolnym wyborem bufora (roztwory wodne lub lizat komórkowy) i bez konieczności immobilizacji. Umożliwia to ilościową analizę interakcji biomolekularnych w roztworze w skali mikrolitrowej, z wysoką czułością (do pM) w ciągu zaledwie kilku minut.
Pomimo prostoty i wszechstronności MST, bufor używany do przeprowadzania pomiarów, zwany buforem MST, zazwyczaj zawiera dodatki mające na celu poprawę jakości sygnału fluorescencyjnego znakowanego celu. Wśród dodatków, surfaktanty takie jak Tween-20, Pluronic F127 czy Triton X100 są bardzo powszechne, aby zapobiec adsorpcji białek na wewnętrznej ścianie kapilar MST. Środki krioochronne, takie jak glicerol czy trehaloza, są często używane do zachowania trójwymiarowej struktury konformacyjnej białek w czasie, gdy są one przechowywane w temperaturze -20°C lub -80°C. Trehaloza i glicerol różnią się jednak mechanizmami działania: trehaloza nie przenika do wnętrza białka i stabilizuje enzymy głównie poprzez zastąpienie wody, podczas gdy glicerol jest czynnikiem penetrującym, który chroni białka bezpośrednio w roztworze wodnym.
Jakie znaczenie mają bufory w aktywności enzymatycznej?
Badacze po raz pierwszy wykorzystali barwnik ATTO-647 NHS ester do znakowania hyaluronidazy dla pomiarów MST w spektrum czerwonym. Porównano trzy różne bufory znakujące: fosforanowo-amonowy, węglanowy i PBS. Najlepsze wyniki uzyskano stosując bufor PBS, który zapewnił najwyższą odzyskaną koncentrację enzymu (8,5 μM) i precyzyjny stopień znakowania (DOL) wynoszący 1, co oznacza, że średnio jedna cząsteczka barwnika przyłącza się do każdej cząsteczki enzymu – idealne warunki pomagające zachować funkcjonalność enzymatyczną i zapewnić spójne zachowanie termoosmotyczne.
Wyniki pokazały, że przy 1 nM znakowanej hyaluronidazy, przy 40% mocy wzbudzenia, sygnał fluorescencyjny wahał się od 2000 do 5500 jednostek we wszystkich testowanych warunkach znakowania, wraz z gładkimi śladami czasowymi MST. Wyjątek zaobserwowano w przypadku buforu węglanowego, gdzie sygnał fluorescencyjny był niski i bliski progu szumu (około 2000 jednostek). W przeciwieństwie do tego, bufory fosforanowo-amonowy i PBS dawały silne intensywności sygnału fluorescencyjnego (odpowiednio 3500 i 5500 jednostek) przy 1 nM hyaluronidazy.
Jednocześnie oceniono aktywność katalityczną znakowanego enzymu i porównano ją z aktywnością nieznakowanego enzymu. Wyniki wykazały, że enzym znakowany w buforze węglanowym był mniej aktywny, co wskazuje na zmniejszoną ilość produktów degradacji. Ta niższa aktywność może być przypisana słabej zdolności buforującej i wahaniom pH spowodowanym rozpuszczaniem się atmosferycznego CO₂ w roztworze w czasie. Takie zmiany pH mogły prowadzić do wytrącania się enzymu podczas procesu znakowania. Tymczasem hyaluronidaza znakowana w buforze PBS lub fosforanowo-amonowym zachowała swoją aktywność katalityczną.
Czy dodatki buforowe wpływają na wyniki pomiarów?
Następnie zbadano wpływ trzech powszechnie stosowanych dodatków buforowych: Tween-20 (surfaktant zapobiegający adsorpcji białek), glicerolu i trehalozy (krioprotektanty) na sygnały MST i aktywność katalityczną enzymu.
Tween-20, testowany w stężeniach od 0,005% do 0,05%, nie wpływał na intensywność sygnału fluorescencyjnego, kształt rozkładu ani na ruch termoosmotyczny znakowanej hyaluronidazy. Równoległa analiza metodą CE-UV wykazała, że Tween-20 nie wpływa znacząco na aktywność enzymatyczną w żadnym z testowanych warunków. “Nasze wyniki potwierdzają, że niejonowe detergenty jak Tween-20 mogą być bezpiecznie stosowane w oznaczeniach MST i CE bez obawy o zaburzenie aktywności enzymatycznej” – piszą autorzy badania.
Co sprawia, że trehaloza zmienia dynamikę enzymu?
Glicerol, badany w stężeniach od 0,02% do 30%, wykazał jedynie niewielki wpływ na sygnał fluorescencyjny, z intensywnością wzrastającą tylko o 7% między 20% a 30%. Między 0,02% a 20%, intensywność fluorescencji i rozkład pozostawały stabilne i symetryczne, wskazując na stałą jakość sygnału. Ponadto, ślad czasowy MST rejestrowany we wszystkich warunkach idealnie się pokrywał, demonstrując gładkie, jednolite profile i brak wykrywalnej interakcji między glicerolem a znakowaną hyaluronidazą.
Równoległe wyniki CE-UV wykazały, że aktywność katalityczna zarówno znakowanej, jak i nieznakowanej hyaluronidazy malała wraz ze wzrostem stężenia glicerolu w medium reakcyjnym, począwszy od 2%. Przy 10% glicerolu aktywność enzymatyczna została zredukowana o połowę, a przy 20% spadła około trzykrotnie. Co ciekawe, analiza MST nie wykazała bezpośredniej interakcji między glicerolem a enzymem, co sugeruje, że spadek aktywności enzymu wynikał prawdopodobnie ze zwiększonej lepkości roztworu, która utrudnia dyfuzję substratu.
Najbardziej fascynujące wyniki uzyskano dla trehalozy. Intensywność sygnału fluorescencyjnego hyaluronidazy wykazała nieliniową zależność od stężenia trehalozy. Przy niskich stężeniach (1% i 5%) intensywność wzrosła o prawie 30%, ale przy 10% i 15% nastąpił gwałtowny spadek o około 50%. Następnie zaobserwowano znaczne odzyskanie sygnału przy 20% i 25%, a maksymalną intensywność zarejestrowano przy 30% trehalozy – około trzykrotnie wyższą niż w próbie kontrolnej. To nieliniowe zachowanie prawdopodobnie odzwierciedla złożoną interakcję między czynnikami mikrośrodowiskowymi indukowanymi przez trehalozę.
Przy niskich stężeniach, ten dodatek może zmniejszać dynamiczne wygaszanie poprzez stabilizację lokalnego środowiska fluoroforu ATTO-647 NHS ester. Spadek fluorescencji przy pośrednich stężeniach może być spowodowany przejściowymi efektami na konformację białka, dostępność fluoroforu lub lokalne zatłoczenie. Przy wyższych stężeniach (20-30%), trehaloza jest rozpuszczona w wodzie objętościowej i jest wyłączona z warstwy solwatacyjnej hyaluronidazy zgodnie z teorią preferencyjnego wykluczania. Ta zwiększona lepkość roztworu prawdopodobnie ogranicza dyfuzję molekularną i dynamiczne wygaszanie, jednocześnie stabilizując ATTO-647 NHS ester, zmniejszając tym samym fotowybielanie i zwiększając intensywność sygnału.
Co ważne, ślady MST pozostawały idealnie nałożone we wszystkich testowanych warunkach, wskazując na brak wykrywalnej interakcji między trehalozą a znakowaną hyaluronidazą i sugerując, że ani rozmiar, ani ładunek białka nie zostały zmienione.
Równocześnie, wyniki CE-UV wykazały, że trehaloza zwiększała aktywność enzymatyczną we wszystkich testowanych stężeniach, z zauważalnym wzrostem już przy 0,02%. Choć aktywność zmniejszyła się o 42% przy 30% trehalozy – prawdopodobnie z powodu zwiększonej lepkości ograniczającej dyfuzję substratu – pozostała ona około dwukrotnie wyższa niż w próbie kontrolnej. Nieznakowany enzym wykazywał porównywalny trend, co dodatkowo potwierdza wiarygodność tych ustaleń.
Czy trehaloza może wpływać na interakcję między hyaluronidazą a jej inhibitorami? Aby odpowiedzieć na to pytanie, badacze przeprowadzili testy wiązania z epigallokatechino-3-galusanem (EGCG), znanym inhibitorem hyaluronidazy. W obecności 10% trehalozy stała dysocjacji (Kd) między EGCG a znakowaną hyaluronidazą wynosiła 153 μM, czyli była czterokrotnie niższa niż w nieobecności trehalozy (686 μM). Sugeruje to, że trehaloza zwiększa powinowactwo wiązania między EGCG a hyaluronidazą, prawdopodobnie poprzez stabilizację konformacji białka w jego stanie złożonym i tym samym ułatwienie dostępu do miejsca inhibicyjnego przez kompaktowy inhibitor.
Podobnie, potencjał inhibicyjny apigeniny-7-glukozydu wzrósł dwukrotnie w obecności 10% trehalozy, a oryginalnie zsyntetyzowanego tetrasacharydu siarczanu chondroityny (CS-4) – prawie trzykrotnie. Te odkrycia pokazują, że trehaloza nie tylko zwiększa aktywność katalityczną enzymu, ale także znacząco wzmacnia skuteczność inhibitorów.
Te obserwacje można wyjaśnić faktem, że trehaloza utrzymuje hyaluronidazę w aktywnej formie, wykluczając warstwę solwatacyjną wokół białka. To wykluczenie promuje stan złożony białka i ogranicza jego mobilność, zapobiegając tym samym denaturacji. Jednocześnie trehaloza oddziałuje również z kwasem hialuronowym. Niedawne badania wykazały, że trehaloza działa jako czynnik stabilizujący dla HA poprzez tworzenie wiązań wodorowych z polarnymi resztami w jego strukturze, zapobiegając tym samym zmianom konformacyjnym. Stabilizacja zarówno hyaluronidazy, jak i kwasu hialuronowego przez trehalozę może zwiększać skuteczność inhibitora, ponieważ ułatwia dostęp EGCG do miejsca inhibicyjnego enzymu, które prawdopodobnie ma charakter allosteryczny.
Jak te wyniki przekładają się na praktykę kliniczną?
Jakie są praktyczne implikacje tych odkryć dla badaczy i klinicystów? Po pierwsze, wyniki podkreślają znaczenie starannej kontroli stężenia glicerolu w oznaczeniach enzymatycznych, aby zapobiec niezamierzonym zmianom w aktywności enzymu. Po drugie, szczególną uwagę należy zwrócić przy wprowadzaniu trehalozy do mediów enzymatycznych – nawet w stężeniach tak niskich jak 0,02% – ponieważ nawet minimalne ilości mogą wpływać na wyniki oznaczeń.
Czy te odkrycia mogą zmienić podejście do projektowania inhibitorów hyaluronidazy i opracowywania nowych terapii? Z pewnością wiedza o tym, jak trehaloza wpływa na interakcje enzym-inhibitor, może pomóc w optymalizacji warunków testowych przy opracowywaniu leków blokujących działanie hyaluronidazy, co może mieć zastosowanie w terapii nowotworowej czy medycynie estetycznej.
Badanie to ma istotne implikacje dla standaryzacji metod badań enzymatycznych w badaniach klinicznych i farmaceutycznych. Dokładne zrozumienie wpływu buforów i dodatków na aktywność enzymatyczną i wiązanie ligandów jest kluczowe dla uzyskania wiarygodnych wyników i opracowania bezpiecznych terapii. Ponadto, wyniki te mogą przyczynić się do rozwoju bardziej efektywnych preparatów terapeutycznych i inhibitorów dla zastosowań medycznych.
W podsumowaniu, badanie to po raz pierwszy systematycznie ocenia wpływ powszechnie stosowanych dodatków buforowych na sygnały MST i aktywność katalityczną hyaluronidazy. Wyniki podkreślają krytyczne znaczenie oceny dodatków buforowych podczas opracowywania oznaczeń – biorąc pod uwagę zarówno ich charakter chemiczny, jak i stężenie – aby zapewnić dokładne, powtarzalne i fizjologicznie istotne wyniki. Zaniedbanie tych czynników może zagrozić wydajności oznaczenia i wprowadzić w błąd przy opracowywaniu skutecznych, długotrwałych związków bioaktywnych dla zastosowań kosmetycznych, farmaceutycznych lub innych biologicznych.
Podsumowanie
Mikroskopowa termofoza (MST) to nowoczesna metoda badania interakcji białko-ligand, wykorzystująca ruch cząsteczek w mikroskopowym gradiencie temperatury. Badanie systematycznie analizuje wpływ dodatków buforowych na wiarygodność oznaczeń MST i aktywność enzymatyczną hyaluronidazy. Wykazano, że Tween-20 nie wpływa znacząco na aktywność enzymatyczną, podczas gdy glicerol w wyższych stężeniach zmniejsza aktywność enzymu poprzez zwiększenie lepkości roztworu. Najciekawsze wyniki uzyskano dla trehalozy, która wykazała nieliniową zależność w intensywności sygnału fluorescencyjnego oraz zwiększała aktywność enzymatyczną. Ponadto, trehaloza wzmacniała skuteczność inhibitorów, takich jak EGCG, apigenina-7-glukozyd i CS-4, poprzez stabilizację konformacji białka. Badanie podkreśla znaczenie starannej kontroli dodatków buforowych w oznaczeniach enzymatycznych i ma istotne implikacje dla rozwoju nowych terapii oraz standaryzacji metod badawczych.
