Mikrofluidyczny chip zmienia zasady denudacji oocytów w procedurach IVF

Czy mikrofluidyczne podejście zmienia zasady denudacji oocytów?

Badanie eksperymentalne opisane w artykule dotyczy nowego podejścia do denudacji oocytów (usuwania komórek otaczających oocyt) przy wykorzystaniu technologii mikrofluidycznej. Autorzy opracowali innowacyjny chip mikrofluidyczny, który umożliwia mechaniczne usuwanie komórek cumulus z kompleksu cumulus-oocyt (COC) bez stosowania enzymatycznej hyaluronidazy.

Badanie zostało przeprowadzone z wykorzystaniem zarówno symulacji komputerowych, jak i testów eksperymentalnych. Autorzy zaprojektowali i wyprodukowali mikrofluidyczny chip wykonany z polimetakrylanu metylu (PMMA), wykorzystując technologię bezpośredniego grawerowania laserem CO₂. Materiał ten został wybrany ze względu na niski koszt w porównaniu do standardowo używanego PDMS (polidimetylosiloksan) oraz lepsze właściwości mechaniczne.

Populacja badana obejmowała oocyty pozyskane z jajników ubitych bawolic w rzeźni Dachlout w prowincji Assiut (Egipt). Oocyty po ekstrakcji były przechowywane w medium TCM 199 i poddawane procesowi dojrzewania w inkubatorze CO₂ w temperaturze 38°C z 5% CO₂ przez 22-24 godziny przed przeprowadzeniem procedury denudacji.

Opracowany chip mikrofluidyczny charakteryzuje się unikalną strukturą kanałów zawierającą jednostki o ząbkowanej powierzchni wewnętrznej (jagged surface units) oraz jednostki ekspansji (expansion units). Ząbkowane powierzchnie generują naprężenia ścinające (wall shear stress), które działają na kompleks cumulus-oocyt, powodując oddzielenie komórek cumulus od oocytu, podczas gdy zaokrąglone jednostki ekspansji ułatwiają ruch obrotowy kompleksu, co zwiększa efektywność denudacji. Chip składa się z dwóch warstw PMMA, z otworami wlotowymi i wylotowymi w górnej warstwie oraz wygrawerowanymi kanałami w dolnej warstwie.

Należy podkreślić, że niepłodność jest chorobą definiowaną jako niemożność poczęcia dziecka po 12 miesiącach (lub więcej) regularnej, niezabezpieczonej aktywności seksualnej. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), 1 na 6 osób wykazuje cechy niepłodności. Chociaż techniki wspomaganego rozrodu (ART), takie jak zapłodnienie in vitro (IVF) i docytoplazmatyczna iniekcja plemnika (ICSI), są powszechnie stosowane w leczeniu niepłodności, obecne procedury wiążą się z wysokimi kosztami, stygmatyzacją społeczną i ograniczoną dostępnością. Ponadto, brak standaryzacji w procedurach ART prowadzi do różnic w wynikach zależnych od operatora.

W kontekście zapłodnienia in vitro, sortowanie plemników i denudacja oocytów są kluczowe dla powodzenia procedury. W jajniku oocyt jest otoczony komórkami cumulus (wyspecjalizowanymi komórkami ziarnistymi), tworząc strukturę znaną jako kompleks cumulus-oocyt (COC). W warunkach in vivo masa komórek cumulus jest usuwana z oocytu podczas zapłodnienia w sposób naturalny. W klinikach IVF komórki cumulus są często usuwane z oocytów w celu ułatwienia zapłodnienia przy użyciu enzymatycznego działania hyaluronidazy i mechanicznego pipetowania.

Autorzy przeprowadzili szczegółowe symulacje CFD (Computational Fluid Dynamics) w programie Ansys Fluent 2020 R2, aby określić optymalne parametry projektowe, takie jak kąt nachylenia ząbków (θ) oraz prędkość przepływu (Q). Przeanalizowano kąty θ = {90°, 120°, 140°, 150°} przy różnych wartościach przepływu Q = {0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25} ml/min. Symulacje wykazały, że najwyższe naprężenia ścinające występują przy kącie θ = 140°, a optymalny przepływ wynosi 1 ml/min.

Warto zaznaczyć, że hyaluronidaza często stosowana w technikach reprodukcyjnych do oddzielania komórek cumulus od oocytów jest enzymem, który hydrolizuje kwas hialuronowy – polisacharyd składający się z powtarzających się jednostek disacharydowych N-acetylo-D-glukozaminy i kwasu D-glukuronowego. W przestrzeni pozakomórkowej kompleksów cumulus-oocyt, kwas hialuronowy tworzy silnie uwodnioną i wiskoelastyczną macierz. Badania wykazały, że leczenie ludzkich oocytów hyaluronidazą zmniejsza przeżywalność oocytów, wskaźniki zapłodnienia i negatywnie wpływa na wskaźniki rozwoju po ICSI. Dodatkowo, wskaźnik zapłodnienia oocytów mysich zmniejszył się po zastosowaniu hyaluronidazy, a oocyty traktowane hyaluronidazą przez 5 minut lub dłużej miały zmniejszoną zdolność do rozwoju do stadium moruli i blastocysty.

Wyniki eksperymentalne potwierdziły wnioski z symulacji. Najwyższą efektywność denudacji (96,7%) oraz wskaźnik wydajności (yield rate) (90%) uzyskano przy kącie nachylenia ząbków θ = 140° i przepływie 1 ml/min. Dla porównania, efektywność denudacji przy innych kątach wynosiła: 79,25% (θ = 150°), 61,62% (θ = 90°) i 42,13% (θ = 120°). Analiza statystyczna (test Wilcoxona przy poziomie istotności 5%) potwierdziła, że konfiguracja z kątem 140° znacząco przewyższa inne konfiguracje pod względem efektywności denudacji.

Co istotne, badanie wykazało brak negatywnego wpływu procesu denudacji na żywotność oocytów i ich potencjał rozwojowy. Wskaźnik zapłodnienia oocytów poddanych denudacji w mikrofluidycznym chipie wynosił 75,34%, a wskaźnik rozwoju do blastocysty osiągnął 94,85%. Autorzy udokumentowali również proces zapłodnienia oraz rozwój zarodków do stadium moruli i wczesnej blastocysty.

W porównaniu z innymi metodami denudacji oocytów, opracowany mikrofluidyczny chip wyróżnia się niskim kosztem produkcji (poniżej 1 USD), prostą strukturą (3 jednostki ząbkowane i 2 jednostki ekspansji) oraz brakiem konieczności stosowania hyaluronidazy. Efektywność denudacji (96,7%) przewyższa wartości raportowane dla innych metod, takich jak system robotyczny (95,0 ± 0,8%) czy wcześniejsze podejścia mikrofluidyczne (93,7%).

Badanie ma istotne znaczenie dla medycyny reprodukcyjnej, oferując potencjalnie tańszą, bardziej efektywną i mniej szkodliwą alternatywę dla enzymatycznej denudacji oocytów w procedurach zapłodnienia in vitro. Eliminacja hyaluronidazy z procesu może poprawić przeżywalność oocytów, wskaźniki zapłodnienia i rozwoju zarodkowego, co przekłada się na wyższą skuteczność technik wspomaganego rozrodu.

Jak parametry CFD wpływają na skuteczność procedury?

Badanie eksperymentalne opisane w artykule dotyczy nowego podejścia do denudacji oocytów (usuwania komórek otaczających oocyt) przy wykorzystaniu technologii mikrofluidycznej. Autorzy opracowali innowacyjny chip mikrofluidyczny, który umożliwia mechaniczne usuwanie komórek cumulus z kompleksu cumulus-oocyt (COC) bez stosowania enzymatycznej hyaluronidazy.

Badanie zostało przeprowadzone z wykorzystaniem zarówno symulacji komputerowych, jak i testów eksperymentalnych. Autorzy zaprojektowali i wyprodukowali mikrofluidyczny chip wykonany z polimetakrylanu metylu (PMMA), wykorzystując technologię bezpośredniego grawerowania laserem CO₂. Materiał ten został wybrany ze względu na niski koszt w porównaniu do standardowo używanego PDMS (polidimetylosiloksan) oraz lepsze właściwości mechaniczne.

Populacja badana obejmowała oocyty pozyskane z jajników ubitych bawolic w rzeźni Dachlout w prowincji Assiut (Egipt). Oocyty po ekstrakcji były przechowywane w medium TCM 199 i poddawane procesowi dojrzewania w inkubatorze CO₂ w temperaturze 38°C z 5% CO₂ przez 22-24 godziny przed przeprowadzeniem procedury denudacji.

Opracowany chip mikrofluidyczny charakteryzuje się unikalną strukturą kanałów zawierającą jednostki o ząbkowanej powierzchni wewnętrznej (jagged surface units) oraz jednostki ekspansji (expansion units). Ząbkowane powierzchnie generują naprężenia ścinające (wall shear stress), które działają na kompleks cumulus-oocyt, powodując oddzielenie komórek cumulus od oocytu, podczas gdy zaokrąglone jednostki ekspansji ułatwiają ruch obrotowy kompleksu, co zwiększa efektywność denudacji. Chip składa się z dwóch warstw PMMA, z otworami wlotowymi i wylotowymi w górnej warstwie oraz wygrawerowanymi kanałami w dolnej warstwie.

Należy podkreślić, że niepłodność jest chorobą definiowaną jako niemożność poczęcia dziecka po 12 miesiącach (lub więcej) regularnej, niezabezpieczonej aktywności seksualnej. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), 1 na 6 osób wykazuje cechy niepłodności. Chociaż techniki wspomaganego rozrodu (ART), takie jak zapłodnienie in vitro (IVF) i docytoplazmatyczna iniekcja plemnika (ICSI), są powszechnie stosowane w leczeniu niepłodności, obecne procedury wiążą się z wysokimi kosztami, stygmatyzacją społeczną i ograniczoną dostępnością. Ponadto, brak standaryzacji w procedurach ART prowadzi do różnic w wynikach zależnych od operatora.

W kontekście zapłodnienia in vitro, sortowanie plemników i denudacja oocytów są kluczowe dla powodzenia procedury. W jajniku oocyt jest otoczony komórkami cumulus (wyspecjalizowanymi komórkami ziarnistymi), tworząc strukturę znaną jako kompleks cumulus-oocyt (COC). W warunkach in vivo masa komórek cumulus jest usuwana z oocytu podczas zapłodnienia w sposób naturalny. W klinikach IVF komórki cumulus są często usuwane z oocytów w celu ułatwienia zapłodnienia przy użyciu enzymatycznego działania hyaluronidazy i mechanicznego pipetowania.

Autorzy przeprowadzili szczegółowe symulacje CFD (Computational Fluid Dynamics) w programie Ansys Fluent 2020 R2, aby określić optymalne parametry projektowe, takie jak kąt nachylenia ząbków (θ) oraz prędkość przepływu (Q). Przeanalizowano kąty θ = {90°, 120°, 140°, 150°} przy różnych wartościach przepływu Q = {0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25} ml/min. Symulacje wykazały, że najwyższe naprężenia ścinające występują przy kącie θ = 140°, a optymalny przepływ wynosi 1 ml/min.

Warto zaznaczyć, że hyaluronidaza często stosowana w technikach reprodukcyjnych do oddzielania komórek cumulus od oocytów jest enzymem, który hydrolizuje kwas hialuronowy – polisacharyd składający się z powtarzających się jednostek disacharydowych N-acetylo-D-glukozaminy i kwasu D-glukuronowego. W przestrzeni pozakomórkowej kompleksów cumulus-oocyt, kwas hialuronowy tworzy silnie uwodnioną i wiskoelastyczną macierz. Badania wykazały, że leczenie ludzkich oocytów hyaluronidazą zmniejsza przeżywalność oocytów, wskaźniki zapłodnienia i negatywnie wpływa na wskaźniki rozwoju po ICSI. Dodatkowo, wskaźnik zapłodnienia oocytów mysich zmniejszył się po zastosowaniu hyaluronidazy, a oocyty traktowane hyaluronidazą przez 5 minut lub dłużej miały zmniejszoną zdolność do rozwoju do stadium moruli i blastocysty.

Wyniki eksperymentalne potwierdziły wnioski z symulacji. Najwyższą efektywność denudacji (96,7%) oraz wskaźnik wydajności (yield rate) (90%) uzyskano przy kącie nachylenia ząbków θ = 140° i przepływie 1 ml/min. Dla porównania, efektywność denudacji przy innych kątach wynosiła: 79,25% (θ = 150°), 61,62% (θ = 90°) i 42,13% (θ = 120°). Analiza statystyczna (test Wilcoxona przy poziomie istotności 5%) potwierdziła, że konfiguracja z kątem 140° znacząco przewyższa inne konfiguracje pod względem efektywności denudacji.

Co istotne, badanie wykazało brak negatywnego wpływu procesu denudacji na żywotność oocytów i ich potencjał rozwojowy. Wskaźnik zapłodnienia oocytów poddanych denudacji w mikrofluidycznym chipie wynosił 75,34%, a wskaźnik rozwoju do blastocysty osiągnął 94,85%. Autorzy udokumentowali również proces zapłodnienia oraz rozwój zarodków do stadium moruli i wczesnej blastocysty.

W porównaniu z innymi metodami denudacji oocytów, opracowany mikrofluidyczny chip wyróżnia się niskim kosztem produkcji (poniżej 1 USD), prostą strukturą (3 jednostki ząbkowane i 2 jednostki ekspansji) oraz brakiem konieczności stosowania hyaluronidazy. Efektywność denudacji (96,7%) przewyższa wartości raportowane dla innych metod, takich jak system robotyczny (95,0 ± 0,8%) czy wcześniejsze podejścia mikrofluidyczne (93,7%).

Badanie ma istotne znaczenie dla medycyny reprodukcyjnej, oferując potencjalnie tańszą, bardziej efektywną i mniej szkodliwą alternatywę dla enzymatycznej denudacji oocytów w procedurach zapłodnienia in vitro. Eliminacja hyaluronidazy z procesu może poprawić przeżywalność oocytów, wskaźniki zapłodnienia i rozwoju zarodkowego, co przekłada się na wyższą skuteczność technik wspomaganego rozrodu.

Czy nowa metoda podnosi efektywność medycyny reprodukcyjnej?

Badanie eksperymentalne opisane w artykule dotyczy nowego podejścia do denudacji oocytów (usuwania komórek otaczających oocyt) przy wykorzystaniu technologii mikrofluidycznej. Autorzy opracowali innowacyjny chip mikrofluidyczny, który umożliwia mechaniczne usuwanie komórek cumulus z kompleksu cumulus-oocyt (COC) bez stosowania enzymatycznej hyaluronidazy.

Badanie zostało przeprowadzone z wykorzystaniem zarówno symulacji komputerowych, jak i testów eksperymentalnych. Autorzy zaprojektowali i wyprodukowali mikrofluidyczny chip wykonany z polimetakrylanu metylu (PMMA), wykorzystując technologię bezpośredniego grawerowania laserem CO₂. Materiał ten został wybrany ze względu na niski koszt w porównaniu do standardowo używanego PDMS (polidimetylosiloksan) oraz lepsze właściwości mechaniczne.

Populacja badana obejmowała oocyty pozyskane z jajników ubitych bawolic w rzeźni Dachlout w prowincji Assiut (Egipt). Oocyty po ekstrakcji były przechowywane w medium TCM 199 i poddawane procesowi dojrzewania w inkubatorze CO₂ w temperaturze 38°C z 5% CO₂ przez 22-24 godziny przed przeprowadzeniem procedury denudacji.

Opracowany chip mikrofluidyczny charakteryzuje się unikalną strukturą kanałów zawierającą jednostki o ząbkowanej powierzchni wewnętrznej (jagged surface units) oraz jednostki ekspansji (expansion units). Ząbkowane powierzchnie generują naprężenia ścinające (wall shear stress), które działają na kompleks cumulus-oocyt, powodując oddzielenie komórek cumulus od oocytu, podczas gdy zaokrąglone jednostki ekspansji ułatwiają ruch obrotowy kompleksu, co zwiększa efektywność denudacji. Chip składa się z dwóch warstw PMMA, z otworami wlotowymi i wylotowymi w górnej warstwie oraz wygrawerowanymi kanałami w dolnej warstwie.

Należy podkreślić, że niepłodność jest chorobą definiowaną jako niemożność poczęcia dziecka po 12 miesiącach (lub więcej) regularnej, niezabezpieczonej aktywności seksualnej. Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), 1 na 6 osób wykazuje cechy niepłodności. Chociaż techniki wspomaganego rozrodu (ART), takie jak zapłodnienie in vitro (IVF) i docytoplazmatyczna iniekcja plemnika (ICSI), są powszechnie stosowane w leczeniu niepłodności, obecne procedury wiążą się z wysokimi kosztami, stygmatyzacją społeczną i ograniczoną dostępnością. Ponadto, brak standaryzacji w procedurach ART prowadzi do różnic w wynikach zależnych od operatora.

W kontekście zapłodnienia in vitro, sortowanie plemników i denudacja oocytów są kluczowe dla powodzenia procedury. W jajniku oocyt jest otoczony komórkami cumulus (wyspecjalizowanymi komórkami ziarnistymi), tworząc strukturę znaną jako kompleks cumulus-oocyt (COC). W warunkach in vivo masa komórek cumulus jest usuwana z oocytu podczas zapłodnienia w sposób naturalny. W klinikach IVF komórki cumulus są często usuwane z oocytów w celu ułatwienia zapłodnienia przy użyciu enzymatycznego działania hyaluronidazy i mechanicznego pipetowania.

Autorzy przeprowadzili szczegółowe symulacje CFD (Computational Fluid Dynamics) w programie Ansys Fluent 2020 R2, aby określić optymalne parametry projektowe, takie jak kąt nachylenia ząbków (θ) oraz prędkość przepływu (Q). Przeanalizowano kąty θ = {90°, 120°, 140°, 150°} przy różnych wartościach przepływu Q = {0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25} ml/min. Symulacje wykazały, że najwyższe naprężenia ścinające występują przy kącie θ = {140°}, a optymalny przepływ wynosi 1 ml/min.

Warto zaznaczyć, że hyaluronidaza często stosowana w technikach reprodukcyjnych do oddzielania komórek cumulus od oocytów jest enzymem, który hydrolizuje kwas hialuronowy – polisacharyd składający się z powtarzających się jednostek disacharydowych N-acetylo-D-glukozaminy i kwasu D-glukuronowego. W przestrzeni pozakomórkowej kompleksów cumulus-oocyt, kwas hialuronowy tworzy silnie uwodnioną i wiskoelastyczną macierz. Badania wykazały, że leczenie ludzkich oocytów hyaluronidazą zmniejsza przeżywalność oocytów, wskaźniki zapłodnienia i negatywnie wpływa na wskaźniki rozwoju po ICSI. Dodatkowo, wskaźnik zapłodnienia oocytów mysich zmniejszył się po zastosowaniu hyaluronidazy, a oocyty traktowane hyaluronidazą przez 5 minut lub dłużej miały zmniejszoną zdolność do rozwoju do stadium moruli i blastocysty.

Wyniki eksperymentalne potwierdziły wnioski z symulacji. Najwyższą efektywność denudacji (96,7%) oraz wskaźnik wydajności (yield rate) (90%) uzyskano przy kącie nachylenia ząbków θ = 140° i przepływie 1 ml/min. Dla porównania, efektywność denudacji przy innych kątach wynosiła: 79,25% (θ = 150°), 61,62% (θ = 90°) i 42,13% (θ = 120°). Analiza statystyczna (test Wilcoxona przy poziomie istotności 5%) potwierdziła, że konfiguracja z kątem 140° znacząco przewyższa inne konfiguracje pod względem efektywności denudacji.

Co istotne, badanie wykazało brak negatywnego wpływu procesu denudacji na żywotność oocytów i ich potencjał rozwojowy. Wskaźnik zapłodnienia oocytów poddanych denudacji w mikrofluidycznym chipie wynosił 75,34%, a wskaźnik rozwoju do blastocysty osiągnął 94,85%. Autorzy udokumentowali również proces zapłodnienia oraz rozwój zarodków do stadium moruli i wczesnej blastocysty.

W porównaniu z innymi metodami denudacji oocytów, opracowany mikrofluidyczny chip wyróżnia się niskim kosztem produkcji (poniżej 1 USD), prostą strukturą (3 jednostki ząbkowane i 2 jednostki ekspansji) oraz brakiem konieczności stosowania hyaluronidazy. Efektywność denudacji (96,7%) przewyższa wartości raportowane dla innych metod, takich jak system robotyczny (95,0 ± 0,8%) czy wcześniejsze podejścia mikrofluidyczne (93,7%).

Badanie ma istotne znaczenie dla medycyny reprodukcyjnej, oferując potencjalnie tańszą, bardziej efektywną i mniej szkodliwą alternatywę dla enzymatycznej denudacji oocytów w procedurach zapłodnienia in vitro. Eliminacja hyaluronidazy z procesu może poprawić przeżywalność oocytów, wskaźniki zapłodnienia i rozwoju zarodkowego, co przekłada się na wyższą skuteczność technik wspomaganego rozrodu.

Podsumowanie

Opracowano innowacyjny chip mikrofluidyczny do denudacji oocytów, który eliminuje konieczność stosowania enzymatycznej hyaluronidazy w procedurach in vitro. Urządzenie, wykonane z polimetakrylanu metylu (PMMA), charakteryzuje się unikalną strukturą kanałów z ząbkowaną powierzchnią wewnętrzną i jednostkami ekspansji. Symulacje CFD i testy eksperymentalne wykazały najwyższą efektywność denudacji (96,7%) przy kącie nachylenia ząbków 140° i przepływie 1 ml/min. Chip wykazuje przewagę nad tradycyjnymi metodami, osiągając wysokie wskaźniki zapłodnienia (75,34%) i rozwoju do blastocysty (94,85%). Dodatkowo, niski koszt produkcji (poniżej 1 USD) i eliminacja szkodliwego wpływu hyaluronidazy czynią tę metodę obiecującą alternatywą w medycynie reprodukcyjnej, potencjalnie zwiększając skuteczność technik wspomaganego rozrodu.