Nanosystemy HSA-HA rewolucjonizują terapię nowotworową

Czy nanosystemy HSA-HA rewolucjonizują dostarczanie leków w terapii onkologicznej?

Postęp w identyfikacji onkogennych czynników napędzających, szlaków sygnałowych, czynników mikrośrodowiska guza i regulatorów immunologicznych przyczynił się w ostatnim dziesięcioleciu do szybkiego rozwoju nowych terapii przeciwnowotworowych, poszerzając możliwości medycyny precyzyjnej. Jednak mikrośrodowisko guza (TME) stanowi złożony, dynamiczny i gęsty system komponentów komórkowych i niekomórkowych, który bezpośrednio wpływa na progresję nowotworu i odpowiedź terapeutyczną. Szczególnie brak funkcjonalnej sieci naczyniowej znacząco utrudnia penetrację leków i ich kontrolowane uwalnianie w obrębie guza. W związku z tym, poprawa perfuzji tkankowej jest kluczową strategią dla zwiększenia efektywności dostarczania leków.

IR780, lipofilny kationowy barwnik bliskiej podczerwieni, zyskał uwagę ze względu na zdolność do zwiększania przepuszczalności naczyń i przepływu płynu śródmiąższowego poprzez terapię fototermalną (PTT) i fotodynamiczną (PDT). Jednak jego zastosowanie kliniczne jest ograniczone przez niestabilne właściwości optyczne, słabą rozpuszczalność w wodzie i wysoką cytotoksyczność. Enkapsulacja IR780 w nanosystemach oferuje obiecujące rozwiązanie tych problemów.

Nanosystemy oparte na ludzkiej albuminie surowiczej (HSA) posiadają wyraźne zalety w pokonywaniu ograniczeń IR780, głównie dzięki ich naturalnej biokompatybilności, biodegradowalności i responsywności strukturalnej. Jako białko endogenne, HSA zapewnia niską immunogenność, wydłużony czas krążenia i zmniejszoną toksyczność systemową. Jej trójwymiarowa struktura zawiera hydrofobowe kieszenie (np. subdomeny IIA i IIIA), które są dobrze przystosowane do enkapsulacji lipofilnego kationowego IR780 poprzez interakcje hydrofobowe i wiązania wodorowe, zapobiegając przedwczesnemu agregowaniu i wyciekaniu. Dodatkowo, HSA ulega konformacyjnym zmianom wywołanym pH w warunkach kwaśnych, gdzie protonacja reszt aminokwasowych (np. histydyny) indukuje odpychanie elektrostatyczne, prowadząc do otwarcia hydrofobowych kieszeni i osłabienia powinowactwa wiązania z lekami. Ta transformacja strukturalna ułatwia precyzyjne uwalnianie leków w miejscu guza. Dlatego nanosystemy oparte na HSA łączą bezpieczeństwo biologiczne z mechanizmem uwalniania reagującym na pH, co czyni je optymalnym nośnikiem dla IR780.

Czy adaptacyjne nanocząstki mogą zoptymalizować penetrację guza?

Pomimo zalet nośników opartych na HSA, głęboka penetracja nanocząstek (NPs) do tkanek nowotworowych pozostaje znaczącym wyzwaniem. Według metaanalizy, w modelach przedklinicznych tylko 0,7% (mediana) dożylnie podawanych nanocząstek gromadzi się w guzie. Jedną z głównych barier jest gęsta macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) w guzach, która hamuje dyfuzję nanocząstek. Zbadano różne strategie zmiękczania lub degradacji ECM, ułatwiające penetrację nanocząstek. Jednak podejścia te często wiążą się z dodatkowymi zagrożeniami, takimi jak promowanie przerzutów nowotworowych. Wielkość nanocząstek również odgrywa kluczową rolę w pokonywaniu tej bariery. Duże nanocząstki (>250 nm) są szybko usuwane przez układ siateczkowo-śródbłonkowy lub zatrzymywane na obwodzie guza z powodu zawady sterycznej. Z kolei małe nanocząstki (<10 nm) mogą być wydalane przez nerki zanim dotrą do guza. Nanocząstki o wielkości około 200 nm wykorzystują jednak efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR), pozwalający im na ekstrawazację z nieszczelnnych naczyń krwionośnych guza i akumulację w śródmiąższu guza. Jeśli rozmiar nanocząstek można dynamicznie dostosowywać w obrębie guza, mogą one lepiej penetrować krętą ECM i docierać do głębszych regionów guza, zwiększając efektywność celowania.

Hialuronidaza (HAase) jest znacząco wyżej ekspresjonowana w gęstej macierzy pozakomórkowej guzów niż w normalnych tkankach, co stwarza możliwość zwiększenia penetracji nanocząstek. Kwas hialuronowy (HA), naturalnie występujący glikozoaminoglikan, charakteryzuje się biokompatybilnością, nieimmunogennością i biodegradowalnością. Może selektywnie celować w nadekspresjonowane receptory CD44 na komórkach nowotworowych poprzez domenę wiążącą HA i szybko degradować się w bogatym w hialuronidazę mikrośrodowisku guza, służąc w ten sposób jako idealny nośnik do celowanego dostarczania leków i kontrolowanego uwalniania. Jednak wykorzystanie go jako powłoki dla nanocząstek ogranicza dostarczanie leków do głębokich regionów guzów. Powłoka HA szybko degraduje się pod wpływem hialuronidazy, a taka wczesna degradacja uniemożliwia nanocząstkom utrzymanie integralności strukturalnej przez wystarczająco długi okres. W rezultacie lek jest uwalniany przed dotarciem do głębszych i trudniejszych obszarów guza, zmniejszając tym samym ogólną skuteczność terapeutyczną. Dlatego głównym celem tego badania jest rozwiązanie problemu efektywności dostarczania leków do głębokich obszarów guza poprzez wykorzystanie synergistycznego efektu adaptacji wielkości i wieloczynnikowego uwalniania, przy jednoczesnym zwiększeniu skuteczności terapeutycznej poprzez połączenie chemioterapii i fototerapii.

Jakie właściwości fizykochemiczne mają IDHNs?

W niniejszym badaniu opracowano wielofunkcyjne nanocząstki IDHNs do synergistycznej terapii nowotworowej. Przygotowane metodą jednoetapowej desolwatacji i sieciowania, uzyskane IDHNs posiadają zoptymalizowane właściwości fizykochemiczne, które umożliwiają nanocząstkom efektywną akumulację w miejscach guzów i minimalizują poważne skutki uboczne załadowanych leków. Ta innowacyjna platforma wykorzystuje charakterystyczne atrybuty swoich komponentów do zwiększenia funkcjonalności. HSA służy jako kluczowy materiał, znacząco zwiększający biokompatybilność nanocząstek. Jego doskonała biokompatybilność zapewnia, że inteligentne nośniki leków IDHNs mogą krążyć w organizmie ze zmniejszonym ryzykiem wywołania reakcji immunologicznych. HA jest włączony do struktury IDHNs w sposób hybrydowy, umożliwiając specyficzne rozpoznawanie receptorów CD44 na komórkach nowotworowych i rozdzielanie się na nienaruszone, ale mniejsze cząstki pod wpływem degradacji enzymatycznej.

IDHNs charakteryzują się dwoma niezależnymi, ale uzupełniającymi się mechanizmami responsywności. Adaptacja wielkości wyzwalana enzymatycznie sprzyja przemieszczaniu się nanocząstek przez gęstą macierz guza, podczas gdy uwalnianie leków reagujące na pH zapewnia, że załadowane leki są precyzyjnie uwalniane w kwaśnym mikrośrodowisku guza. Dodatkowo, zastosowanie zewnętrznego lasera bliskiej podczerwieni (NIR) może zwiększyć uwalnianie leku przy jednoczesnym umożliwieniu PDT i PTT. Zaprojektowane IDHNs poprawiły właściwości celowania do guzów DOX i IR780, jednocześnie zmniejszając ich toksyczne skutki uboczne. Te IDHNs wykazują zdolność dostarczania leków ukierunkowanych na guzy, z uwalnianiem leków wyzwalanym przez zewnętrzne naświetlanie laserem, aktywność enzymatyczną i kwaśne mikrośrodowisko guza, ostatecznie zwiększając skuteczność skojarzonej chemio-fototermicznej terapii.

Czy enzymatyczne wyzwalanie mniejszych cząstek poprawia penetrację?

HA w IDHNs jest kluczowy dla umożliwienia dostosowania wielkości w odpowiedzi na mikrośrodowisko guza. HAase, obficie występująca w kwaśnej macierzy pozakomórkowej guzów, specyficznie celuje i degraduje HA. Wykorzystując tę cechę, DLS zastosowano do monitorowania ewolucji wielkości nanocząstek reagujących na enzymy. Wyniki ujawniły zależne od stężenia enzymu i czasu inkubacji zmniejszenie średnicy nanocząstek. Początkowo IDHNs miały medianę średnicy (ID50) hydrodynamicznej wielkości ~200 nm, która zmniejszyła się do ~75 nm po 3 godzinach inkubacji z HAase (300 U/mL). Jednak gdy stężenie enzymu osiąga 450 U/mL, mediana średnicy hydrodynamicznej cząstek zmniejsza się w porównaniu z 300 U/mL, ale bez istotnej różnicy. Jak zmierzono za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA), stwierdzono, że po traktowaniu 300 U/mL HAase przez 3 godziny, stężenie nanocząstek wzrosło około 3,5-krotnie w porównaniu do grupy nieleczonej. Ten wynik dodatkowo potwierdza, że zmniejszenie wielkości nanocząstek opiera się na rozszczepieniu, a nie na degradacji warstwy zewnętrznej.

Aby potwierdzić, że zmiana wielkości była spowodowana odpowiedzią enzymatyczną, a nie niestabilnością, stabilność IDHNs testowano w wodzie, soli fizjologicznej i PBS (pH 7,4). IDHNs utrzymywały spójny rozkład wielkości, nie wykazując spontanicznej agregacji ani rozpadu. Pomiary mętności potwierdziły stabilność IDHN w surowicy cielęcej płodowej, bez znaczącej agregacji czy sedymentacji. Wyniki te wskazują, że IDHNs mogłyby utrzymać integralność strukturalną podczas krążenia systemowego i podlegać modulacji wielkości tylko po ekspozycji na HAase.

Jak zapewnić stabilność i efektywność fototermiczną w terapii?

IR780, o doskonałych właściwościach fototermalnych, jest powszechnie stosowany w terapii nowotworowej, ale jest podatny na wygaszanie pod wpływem ekspozycji na światło. Aby ocenić stabilność IR780 w nanocząstkach, zarejestrowaliśmy widma UV wolnego IR780 i IDHNs załadowanych IR780 w warunkach przechowywania w ciemności lub na świetle. Wolny IR780 wygaszał się pod wpływem ekspozycji na światło, z zanikiem piku absorpcji przy 780 nm. Natomiast IDHNs załadowane IR780 utrzymywały pik 780 nm w obu warunkach, wykazując zwiększoną fotostabilność dzięki enkapsulacji. Testy hemolizy IDHNs wykazały, że przy stężeniach między 50 a 400 μg/mL, wskaźnik hemolizy pozostawał poniżej 5%. Czerwone krwinki (RBCs) traktowane nawet 400 μg/mL IDHNs zachowały swój charakterystyczny dwuwklęsły kształt bez oznak lizy, wskazując na dobrą biokompatybilność.

Efekt fototermalny IDHNs jest kluczowy dla ich skuteczności w fototermalnej terapii nowotworowej. Aby zoptymalizować okno terapeutyczne, systematycznie zbadano zależną od stężenia odpowiedź fototermalną IDHNs pod naświetlaniem laserem NIR 808 nm (1,5 W/cm², 0-5 min). Efekt fototermalny IDHNs wzrastał przy wyższych stężeniach IR780. Przy 40 μg/mL IR780 wydajność konwersji fototermalnej IDHNs osiągnęła 13,8%, a temperatura wzrosła o 20°C (ΔT = 20,0°C), osiągając wymaganą temperaturę do efektywnej fototermalnej terapii nowotworowej, wystarczającą do wywołania nieodwracalnych uszkodzeń komórkowych. Ten efekt fototermalny wywołuje martwicę i apoptozę poprzez zaburzenie integralności błony, denaturację białek cytoplazmatycznych i indukcję uszkodzeń DNA.

Jakie mechanizmy fotodynamiczne i mitochondrialne aktywują IDHNs?

Aby zbadać generowanie reaktywnych form tlenu (ROS) przez nanocząstki pod wpływem napromieniania laserem, 1,3-difenylizobenzofuran (DPBF) został użyty jako sonda fluorescencyjna do ilościowego określenia produkcji tlenu singletowego. DPBF ma wyraźny pik absorpcji przy 420 nm w widmie UV, który zmniejsza się po reakcji z tlenem singletowym, pozwalając na ocenę generowania ROS poprzez monitorowanie redukcji absorpcji DPBF. Ta metoda została zastosowana do oceny generowania ROS przez nanocząstki załadowane IR780 in vitro, oceniając ich potencjał do PDT. Stopień zmniejszenia stężenia DPBF jest odwrotnie proporcjonalny do generowania ROS przez IDHNs, czyniąc go wiarygodnym wskaźnikiem ich efektu fotodynamicznego. IDHNs wykazały bardziej oczywisty wzrost wydajności generowania ROS niż IHNs, ale był on niższy niż wolny IR780, co zostało dalej potwierdzone za pomocą sondy specyficznej dla tlenu singletowego SOSG. Wynika to głównie z faktu, że wolny IR780, w stanie nieenkapsulowanym, jest wolny od przestrzennych ograniczeń struktury IDHNs, pozwalając mu na bardziej efektywną absorpcję światła NIR i tym samym bardziej efektywne wytwarzanie ROS. Dodatkowo, cząsteczki IR780 mają tendencję do agregacji poprzez nakładanie się π-π, co powoduje wygaszanie wywołane agregacją (ACQ). W tym kontekście, DOX w IDHNs może hamować agregację IR780 poprzez interakcje hydrofobowe i elektrostatyczne, ten potencjalny efekt może pomóc utrzymać więcej IR780 w rozproszonym stanie pojedynczych cząsteczek, wspierając tym samym efektywną absorpcję światła i konwersję ROS. Obserwowane zwiększenie generowania ROS po włączeniu DOX jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o potencjowaniu produkcji tlenu singletowego przez środki chemioterapeutyczne w nanosystemach opartych na albuminie.

Zbadaliśmy dalej wpływ IDHNs na funkcję mitochondrialną, kluczowe zdarzenie downstream w odpowiedziach komórkowych indukowanych przez PDT. Barwienie JC-1 oceniające depolaryzację mitochondrialną pokazuje, że PDT i chemioterapia znacząco zwiększyły depolaryzację potencjału błony mitochondrialnej w porównaniu z kontrolami. W porównaniu z IHNs, IDHNs dalej indukowały bardziej wyraźną depolaryzację mitochondrialną, a efekt ten prawdopodobnie wiąże się z generowaniem wewnątrzkomórkowych ROS indukowanych przez DOX. Dane te potwierdzają, że ekspozycja IDHNs na napromienianie laserem NIR silnie indukuje uszkodzenia mitochondrialne.

Czy adaptacyjna wielkość poprawia dostarczanie leków do głębokich obszarów guza?

Ze względu na różne fizjologiczne progi wielkości i zależne od wielkości interakcje nanobiologiczne w organizmie, wielkość nanocząstek odgrywa kluczową rolę w regulacji ich zachowania transportowego in vivo. Aby zbadać rolę właściwości adaptacji wielkości IDHNs w głębokim dostarczaniu leków, najpierw oceniliśmy wpływ adaptacji wielkości wyzwalanej przez enzymy na penetrację guza przez nanocząstki. IDHNs po traktowaniu HAase inkubowano z tkankami guza. Głębokość penetracji leków i akumulacja w guzie znacząco wzrosły przy zwiększonym rozszczepianiu nanocząstek i wydłużonej inkubacji. Sekcje guza ujawniły, że duże cząstki gromadziły się głównie na obwodzie guza, podczas gdy enzymatycznie rozszczepione mniejsze cząstki potomne wykazywały rozszerzoną dystrybucję w kierunku centrum guza. W porównaniu z nienaruszonymi IDHNs, głębokość penetracji rozszczepionych cząstek wzrosła z mniej niż 50 μm do około 400 μm, a akumulacja fluorescencji cząstek w obszarze rdzenia guza wzrosła o około 124%. Aby potwierdzić, czy zmniejszenie wielkości ułatwiło przemieszczanie się nanocząstek w ECM, tkanki guza zostały pozbawione komórek przez 1% SDS, a pozostała HAase została zneutralizowana przez HA, aby stworzyć ECM wolną od enzymów. Mniejsze IDHNs wykazały najwyższą dyfuzję i akumulację w ECM, która była 2,7 razy większa niż w grupie kontrolnej.

Czy IDHNs potrafią skutecznie penetrować strukturę sferoidów guza?

Następnie, wielokomórkowe sferoidy guza pochodzące z komórek 4T1 zostały wygenerowane w płytkach wielodołkowych z wkładkami mikrodołkowymi, aby naśladować morfologię i mikrośrodowisko guzów litych, oceniając penetrację IDHNs podczas napromieniania laserem NIR in vitro. Na głębokości 30 μm, zarówno wolny DOX, jak i IDHNs wykazały dobrą penetrację. Jednak IDHNs pod napromienianiem laserem NIR wykazały znacznie zwiększoną penetrację i akumulację w sferoidzie. IDHNs traktowane napromienianiem laserem NIR wykazały wiele złuszczonych komórek, ze względu na apoptozę i złuszczanie się komórek powierzchniowych indukowane termicznie. Wyniki te sugerują, że IDHNs, pod ekspozycją na laser NIR, penetrują i akumulują się w sferoidach guza bardziej efektywnie niż konwencjonalne leki.

Jakie są konsekwencje skutecznego docierania do hipoksycznych regionów guza?

Czynnik indukowany hipoksją 1α (HIF-1α), kluczowy biomarker hipoksji guza, jest ekspresjonowany na znacznie wyższych poziomach w rdzeniu guza w porównaniu z otaczającymi tkankami. Używając HIF-1α jako markera przestrzennego, oceniliśmy penetrację tkankową IDHNs, badając ich kolokalizację z HIF-1α w sekcjach guza. Mikroskopia fluorescencyjna ujawniła, że w hipoksycznym rdzeniu guza wolny DOX wykazał nieznaczną penetrację, z minimalną obserwowaną fluorescencją. Natomiast IDHNs znacząco akumulowały się w tym hipoksycznym środowisku. Analiza ilościowa za pomocą oprogramowania ImageJ potwierdziła, że wolny DOX wykazał niewielkie nakładanie się z fluorescencją HIF-1α, podczas gdy IDHNs wykazały znaczącą kolokalizację. Analiza współczynnika korelacji Pearsona wykazała, że korelacja dla wolnego DOX i HIF-1α wynosiła tylko 0,076, podczas gdy dla IDHNs wynosiła 0,4256, odzwierciedlając silniejszą korelację. Statystyczne porównanie wielu pól potwierdziło znaczącą różnicę w kolokalizacji między dwiema grupami. Wyniki te pokazują, że IDHNs mają lepszą penetrację tkanek w porównaniu z wolnym DOX, umożliwiając lepsze dostarczanie do hipoksycznych regionów guza, niezbędnych dla efektywnej terapii. Ta poprawiona penetracja jest prawdopodobnie spowodowana dwoma czynnikami: Po pierwsze, składnik HA w IDHNs umożliwia rozszczepianie wyzwalane przez enzymy, pozwalając na adaptację wielkości do poruszania się po gęstych matrycach guza. Po drugie, efekt fototermalny IR780 zwiększa płynność śródmiąższową guza, dodatkowo zwiększając penetrację IDHNs. Jednak eksperymenty in vitro nie mogą w pełni symulować złożonego mikrośrodowiska in vivo, takiego jak hemodynamika, co mogłoby być dalej potwierdzone przez mikroskopię przyżyciową w przyszłości.

Czy IDHNs zapewniają skuteczne pobieranie komórkowe dzięki celowaniu przez CD44?

Skuteczność terapeutyczna leku jest zależna od jego pomyślnej endocytozy przez komórki po penetracji tkanek. Aby wyjaśnić mechanizm pobierania komórkowego IDHNs, przeprowadzono badania in vitro. W porównaniu z wolnym DOX, gdy był załadowany w HSA, intensywność fluorescencji obserwowana w jądrze komórkowym była zmniejszona. Natomiast IDHNs, które zawierały HA, wykazały znacznie zwiększone pobieranie komórkowe, ponieważ epitopy HA specyficznie wiążą się z receptorami CD44 nadekspresjonowanymi na komórkach nowotworowych. Aby dalej potwierdzić szlak pobierania pośredniczony przez CD44, przeprowadzono eksperymenty blokady konkurencyjnej poprzez dodanie nadmiaru wolnego HA. Gdy receptor CD44 został wstępnie zablokowany wolnym HA, intensywność fluorescencji znacząco spadła. Wyniki te silnie sugerowały, że IDHNs poprzez endocytozę pośredniczoną przez receptor CD44 specyficznie celują w komórki nowotworowe.

Czy synergizm chemioterapii i fototerapii zwiększa cytotoksyczność IDHNs?

Następnie, synergistyczna cytotoksyczność leczenia pośredniczonego przez IDHNs, chemioterapii ukierunkowanej na guzy i PTT/PDT, została oceniona za pomocą testu MTT. Najpierw wstępnie oceniono cytotoksyczność samych nośników nanocząstek i napromieniania laserem in vitro. Po leczeniu komórek 4T1 i ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs), nanocząstki HSA-HA wykazały wyjątkową biokompatybilność w różnych stężeniach, utrzymując żywotność komórek stale powyżej 90%. Ponadto, samo napromienianie laserem NIR nie wpłynęło znacząco na proliferację komórek 4T1, nawet przy intensywności mocy 1,5 W/cm². Następnie, ciemne cytotoksyczności wolnego DOX, wolnego IR780, IHNs, IDHNs w różnych stężeniach zostały osobno ocenione wobec komórek 4T1 za pomocą testu MTT. Wolny IR780 zmniejszył żywotność komórek do 6,6% przy 40 μg/mL. Enkapsulacja IR780 w HSA-HA znacząco zmniejszyła jego cytotoksyczność w nieobecności światła, z 36,7% żywotnością komórek przy 40 μg/mL po 24 godzinach. Gdy traktowano IDHNs (DOX: 22 μg/mL, IR780: 40 μg/mL), tylko 19,17% komórek przeżyło. Wyniki te pokazują, że podczas gdy wolny IR780 indukuje znaczącą cytotoksyczność, jego enkapsulacja w nanocząstkach HSA-HA łagodzi ten efekt, poprawiając profil bezpieczeństwa IR780 poprzez zmniejszenie jego toksyczności.

Jak IDHNs aktywują immunologiczną odpowiedź przeciwnowotworową?

Aby ocenić indukcję immunogennej śmierci komórkowej (ICD), kluczowego procesu łączącego bezpośrednią cytotoksyczność z ogólnoustrojową odpornością przeciwnowotworową, przeprowadzono dodatkowe badania. Ledwo sygnały kalretkuliny (CRT) zaobserwowano w komórkach 4T1 traktowanych PBS, a sama chemioterapia lub fototerapia indukowały silniejsze barwienie CRT. Szczególnie, najwyższe barwienie CRT zaobserwowano w komórkach traktowanych IDHNs i napromienianiem laserem. Dodatkowo, fluorescencja białka grupy wysokiej mobilności 1 (HMGB1) korelowała negatywnie z ekspresją CRT w różnych leczeniach. Wyniki te wskazują, że połączenie chemioterapii i fototerapii z IDHNs nie tylko bezpośrednio zabija komórki nowotworowe, ale także aktywuje odpowiedź immunogenną poprzez ICD.

Czy IDHNs gwarantują bezpieczeństwo biologiczne w badaniach in vivo?

Następnie przeprowadzono kompleksową ocenę bezpieczeństwa in vivo IDHNs, aby systematycznie potwierdzić ich biokompatybilność. W szczególności, przeprowadzono oceny markerów funkcji wątroby w surowicy, wskaźników funkcji nerek i parametrów hematologicznych u leczonych myszy. Wyniki łącznie wykazały, że IDHNs wykazywały korzystny profil bezpieczeństwa in vivo, bez wykrywalnej dysfunkcji narządów lub nieprawidłowości hematologicznych, jak oceniono przez testy funkcji wątroby i nerek w surowicy oraz badanie rutynowe krwi. In vivo, obrazowanie termograficzne w podczerwieni potwierdziło korzystną zdolność konwersji fototermalnej IDHNs.

Jakie wyniki uzyskano w zakresie celowania leków za pomocą obrazowania IVIS?

Aby kompleksowo ocenić wydajność celowania leków, obrazy fluorescencyjne zostały uchwycone w różnych punktach po iniekcji za pomocą systemu obrazowania IVIS. Wszystkie grupy stopniowo gromadziły się w miejscu guza w czasie. Szczególnie, 24 godziny po iniekcji, IDHNs osiągnęły maksymalne stężenie w guzie, wykazując znacznie wyższy poziom wzbogacenia niż obserwowany z wolnym IR780. Następnie przeprowadzono analizę obrazowania IVIS głównych narządów, w tym serca, wątroby, śledziony, płuc i nerek.

Czy terapia IDHNs skutkuje znaczącą redukcją guza?

Gdy guz miał około 80 mm³ objętości, myszy noszące guzy leczono zgodnie z protokołem. Krzywa wzrostu objętości guza pokazała, że IDHNs z napromienianiem laserem (chemiofototerapia) osiągnęły 93,5% redukcję objętości guza, przewyższając DHNs (chemioterapia), które zmniejszyły objętość guza o 58,71%, i IHNs z ekspozycją na laser (fototerapia), które dały 78,98% redukcję. Pomiary wagi guza dodatkowo potwierdziły te ustalenia. Myszy leczone wolnym DOX miały 22,0% redukcję wagi guza w porównaniu z kontrolami, podczas gdy te leczone samymi DHNs wykazały 45,8% redukcję. Myszy otrzymujące IHNs (fototerapia) i IDHNs (chemiofototerapia) z napromienianiem laserem wykazały 44,5% i 80,9% redukcje wagi guza, odpowiednio. Analiza histopatologiczna ujawniła, że IDHNs z napromienianiem laserem spowodowały rozległą śmierć komórkową, zaznaczoną przez pyknozę jądrową i znaczącą infiltrację komórek immunologicznych w mikrośrodowisku guza. Wyniki te podkreślają lepszą skuteczność przeciwnowotworową IDHNs w połączeniu z napromienianiem laserem i ich potencjał do aktywacji odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej. Brak całkowitej ablacji guza, pomimo skojarzonego podejścia terapeutycznego, może być przypisany kilku parametrom eksperymentalnym. Początkowa objętość guza (~80 mm³) była większa niż w badaniu raportującym pełną eradykację. Gęstość mocy lasera (1,5 W/cm²) skutkowała temperaturami wewnątrz guza około 47-49°C, co jest wystarczające do wywołania szeroko rozpowszechnionej apoptozy i martwicy, jak potwierdzono histologicznie, ale poniżej progu typowo wymaganego do natychmiastowej martwicy koagulacyjnej (>50°C). Ponadto, dawka środka fototermalnego (2,0 mg/kg) i czas leczenia (14 dni) były konserwatywne w porównaniu z niektórymi opublikowanymi protokołami. Warto zauważyć, że nawet badania stosujące wyższe dawki lub gęstości mocy nie zawsze osiągają całkowitą ablację, podkreślając zmienność wyników w różnych modelach i warunkach leczenia.

Czy IDHNs minimalizują toksyczność systemową?

Przez cały okres leczenia, myszy w grupach leczonych IDHNs utrzymywały stabilną masę ciała, porównywalną z grupą kontrolną PBS, wskazując na minimalną toksyczność systemową. Badanie histologiczne głównych narządów (serce, wątroba, śledziona i nerki) nie ujawniło wyraźnych oznak uszkodzeń lub nieprawidłowych zmian komórkowych. Łagodna infiltracja komórek zapalnych była obserwowana tylko w tkankach płuc myszy noszących guzy. Detekcja ELISA czynników zapalnych IL-6 i TNF-α w surowicy pokazała, że IDHNs nie indukowały ogólnoustrojowego zapalenia. Biorąc pod uwagę, że to odkrycie jest zgodne z charakterystyką formowania niszy przedprzerzutowej powszechnie związanej z progresją raka piersi 4T1, prawdopodobnie nie jest to wynik toksyczności indukowanej leczeniem. Łącznie, IDHNs, zaprojektowane do synergistycznej chemioterapii wraz z PTT i PDT, wykazują znaczącą skuteczność przeciwnowotworową i wyjątkowe bezpieczeństwo biologiczne in vivo. Integracja celowanego dostarczania leków, zewnętrznego napromieniania laserem/HAase/kwaśnego mikrośrodowiska guza wyzwalającego uwalnianie leków, cytotoksyczności indukowanej światłem, enzymatycznie wyzwalanych rozszczepianych średnic nanocząstek w mikrośrodowisku guza dla głębokiej penetracji guza i aktywacji układu immunologicznego pozycjonuje IDHNs jako obiecującego kandydata do rozwoju skojarzonej terapii nowotworowej.

Jak dynamiczna regulacja wielkości wpływa na efektywność dostarczania leków?

Gęste mikrośrodowisko guza, charakteryzujące się nieprawidłową macierzą pozakomórkową, kwaśnym pH i słabym unaczynieniem, stanowi istotne przeszkody w efektywnym dostarczaniu leków. Aby pokonać te bariery, opracowaliśmy reagujące na hialuronidazę/kwas/światło NIR nanocząstki o adaptacyjnej wielkości, IDHNs, które integrują dynamiczną adaptację wielkości, celowane dostarczanie i terapię multimodalną. Krytyczne wyzwanie w dostarczaniu leków do guzów leży w nieodłącznej sprzeczności wymagań wielkościowych dla nośników nano w kaskadzie dostarczania, szczególnie dla krążenia systemowego, penetracji guza i pobierania komórkowego. IDHNs mają duży potencjał do rozwiązania tej sprzeczności, wraz z ograniczeniami konwencjonalnych nanoleków, poprzez ich unikalną zdolność adaptacji wielkości.

Jak raportowaliśmy, podczas początkowej fazy obserwacji, cząstki o przybliżonej wielkości ~10 nm zostały wykryte we wszystkich grupach, choć w mniejszej ilości. To zjawisko jest ściśle związane z fundamentalną strukturą IDHNs, które składają się z monomerów/polimerów HSA i są “sklejone” przez HA, przy czym średnica monomerów HSA wynosi około 8 nm. Sugeruje to, że w idealnych warunkach (wystarczające stężenie enzymu i nieograniczony czas reakcji) IDHNs mogą rozszczepiać się do punktu końcowego o wielkości 8 nm. Analiza TEM ujawnia, że rozszczepianie IDHNs nie jest ani synchroniczne, ani nie podąża za prostym modelem “binarnego rozszczepiania”. Zamiast tego, wykazuje adaptacyjne cechy rozszczepiania zależne zarówno od czasu, jak i stężenia enzymu. Co ważne, każda mniejsza cząstka potomna zachowuje potencjał do dalszego rozszczepiania przed osiągnięciem punktu końcowego 8 nm. Podsumowując, wielkość IDHNs może być dynamicznie regulowana w zakresie od ~200 nm do 8 nm, oferując szerszy zakres wielkości niż inne raportowane cząstki o zmiennej wielkości. Ta elastyczność pozwala IDHNs spełnić różne wymagania wielkościowe dla różnych etapów dostarczania leków, w tym krążenia krwi (większe rozmiary dla przedłużonej retencji), penetracji tkanek (średnie rozmiary do przejścia przez bariery) i pobierania komórkowego (mniejsze rozmiary do wejścia do komórek).

Czy multimodalna aktywacja nanocząstek przełamuje bariery terapii przeciwnowotworowej?

Multimodalna aktywacja IDHNs, poprzez HAase, kwaśne pH i światło NIR synergistycznie zwiększa efekty przeciwnowotworowe. In vitro, IDHNs indukowały ponad 90% cytotoksyczność w komórkach 4T1 pod napromienianiem laserem, przewyższając pojedyncze terapie. IDHNs zmniejszyły objętość guza o 93,5%, znacząco więcej niż sama chemioterapia (58,7%) lub sama fototerapia (78,9%). To podejście kombinowane nie tylko bezpośrednio zabija komórki nowotworowe, ale także poprawia penetrację leków i przepuszczalność naczyń. Konstrukcja podwójnego nośnika HSA i HA zwiększa celowanie i biokompatybilność, z HA ułatwiającym aktywne celowanie poprzez endocytozę pośredniczoną przez CD44. Co ważne, IDHNs indukują ICD, mając potencjał do aktywacji ogólnoustrojowej odporności przeciwnowotworowej i zapewniając strategię zarówno dla leczenia lokalnego, jak i systemowego.

Chociaż obiecujące, dalsza walidacja w modelach zwierzęcych na większą skalę jest nadal potrzebna, aby potwierdzić uniwersalność jego zastosowania klinicznego. Dodatkowo, aby rozszerzyć zakres zastosowania klinicznego tej platformy dostarczania, jednym z głównych kierunków badań jest zwiększenie responsywności IDHNs w guzach o niskich poziomach hialuronidazy. Ten cel może być osiągnięty poprzez kaskadowe dostarczanie PEGylowanej rekombinowanej ludzkiej hialuronidazy (PEGPH20) i IDHNs. PEGPH20 może specyficznie usunąć barierę zrębu HA guza, jednocześnie wykorzystując efekt synergistyczny do ułatwienia wywołania właściwości adaptacji wielkości IDHNs, tym samym znacząco zwiększając penetrację tkanek. Jednak konieczne jest dodatkowo zrównoważenie korzyści terapeutycznych leczenia guza i potencjalnego ryzyka przerzutów. Jednocześnie, optymalizacja leków ładowanych przez IDHNs jest również kluczowa. Badanie potencjalnego połączonego zastosowania IDHNs z inhibitorami punktów kontrolnych immunologicznych ma szansę dalej poprawić skuteczność leczenia raka poprzez efekty synergistyczne.

W tym badaniu opracowano wielofunkcyjne nanocząstki IDHNs na bazie HSA i HA, które wykazują zdolność do adaptacji wielkości pod wpływem enzymów, umożliwiając głębszą penetrację guza i efektywne dostarczanie leków. Nanocząstki te skutecznie enkapsulują zarówno DOX (chemioterapeutyk) jak i IR780 (środek fototermalny/fotodynamiczny), zapewniając kontrolowane uwalnianie leków w odpowiedzi na kwaśne pH mikrośrodowiska guza, obecność hialuronidazy oraz naświetlanie światłem bliskiej podczerwieni. Synergistyczne działanie chemioterapii i fototerapii znacząco zwiększa skuteczność przeciwnowotworową, co potwierdzono zarówno w badaniach in vitro jak i na modelach zwierzęcych. Co ważne, IDHNs wykazują zdolność do indukowania immunogennej śmierci komórkowej, potencjalnie aktywując odpowiedź immunologiczną organizmu przeciwko guzowi. Platforma ta oferuje obiecującą strategię dla precyzyjnej, multimodalnej terapii nowotworowej, łącząc celowane dostarczanie leków, kontrolowane uwalnianie i synergistyczne działanie terapeutyczne.

Podsumowanie

Badanie przedstawia innowacyjną platformę nanocząstek IDHNs (opartych na ludzkiej albuminie surowiczej i kwasie hialuronowym) do zaawansowanej terapii nowotworowej, która rozwiązuje kluczowy problem efektywnego dostarczania leków do głębokich obszarów guza. System ten wykorzystuje unikalną właściwość adaptacji wielkości – nanocząstki o początkowej średnicy około 200 nm, pod wpływem hialuronidazy obecnej w mikrośrodowisku guza, rozszczepiają się do mniejszych cząstek potomnych (nawet do 8 nm), co umożliwia im skuteczną penetrację przez gęstą macierz pozakomórkową i dotarcie do hipoksycznych regionów guza, gdzie tradycyjne terapie zawodzą.

Nanocząstki IDHNs enkapsulują zarówno doksorubicynę (chemioterapeutyk), jak i IR780 (środek do terapii fototermalnej i fotodynamicznej), zapewniając kontrolowane uwalnianie leków w odpowiedzi na trzy bodźce: kwaśne pH guza, aktywność enzymatyczną hialuronidazy oraz naświetlanie laserem bliskiej podczerwieni. Warstwa kwasu hialuronowego nie tylko umożliwia adaptację wielkości, ale także zapewnia aktywne celowanie poprzez wiązanie z receptorami CD44 nadekspresjonowanymi na komórkach nowotworowych. Enkapsulacja IR780 w strukturze nanocząstek znacząco poprawia jego fotostabilność i zmniejsza toksyczność systemową, jednocześnie zachowując doskonałe właściwości fototermalnej konwersji – przy stężeniu 40 μg/mL temperatura wzrasta o 20°C, co wystarcza do wywołania nieodwracalnych uszkodzeń komórkowych.

Badania in vitro wykazały, że IDHNs po enzymatycznym rozszczepieniu penetrują tkanki guza na głębokość około 400 μm (w porównaniu z mniej niż 50 μm dla nienaruszonych cząstek), a ich akumulacja w obszarze rdzenia guza wzrasta o 124%. Szczególnie istotne jest to, że nanocząstki te skutecznie docierają do hipoksycznych regionów guza bogatych w HIF-1α, gdzie tradycyjne leki praktycznie nie penetrują. Współczynnik korelacji Pearsona dla IDHNs i HIF-1α wynosił 0,4256, podczas gdy dla wolnej doksorubicyny jedynie 0,076, co potwierdza znacząco lepszą penetrację.

Synergistyczne działanie chemioterapii i fototerapii przynosi wybitne rezultaty terapeutyczne. W badaniach in vitro, IDHNs pod naświetlaniem laserem indukowały ponad 90% cytotoksyczność w komórkach 4T1, przewyższając pojedyncze terapie. W modelach zwierzęcych, leczenie IDHNs z naświetlaniem laserem skutkowało 93,5% redukcją objętości guza, znacząco więcej niż sama chemioterapia (58,7%) czy sama fototerapia (78,9%). Co równie ważne, nanocząstki te indukują immunogenną śmierć komórkową poprzez ekspozycję kalretykuliny i uwalnianie HMGB1, co potencjalnie aktywuje ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną przeciwko nowotworowi.

Profil bezpieczeństwa IDHNs jest wyjątkowo korzystny – badania hemolizy wykazały, że nawet przy wysokich stężeniach (400 μg/mL) wskaźnik hemolizy pozostaje poniżej 5%, a czerwone krwinki zachowują swój charakterystyczny kształt. Badania in vivo potwierdziły brak wykrywalnej dysfunkcji narządów, nieprawidłowości hematologicznych czy systemowego zapalenia. Myszy leczone IDHNs utrzymywały stabilną masę ciała przez cały okres leczenia, a analiza histopatologiczna głównych narządów nie ujawniła oznak uszkodzeń.

System IDHNs rozwiązuje fundamentalną sprzeczność wymagań wielkościowych dla nośników leków w różnych etapach dostarczania – większe cząstki są potrzebne do przedłużonego krążenia we krwi, średnie do penetracji przez bariery tkankowe, a małe do efektywnego pobierania przez komórki. Dzięki dynamicznej regulacji wielkości w zakresie od 200 nm do 8 nm, IDHNs spełniają wszystkie te wymagania sekwencyjnie. Ta innowacyjna platforma, łącząca celowane dostarczanie leków, kontrolowane uwalnianie reagujące na mikrośrodowisko guza i synergistyczne działanie terapeutyczne, stanowi obiecującą strategię dla precyzyjnej, multimodalnej terapii nowotworowej, choć wymaga jeszcze walidacji w modelach zwierzęcych na większą skalę przed potencjalnym zastosowaniem klinicznym.